La conservazione dei campioni vegetali è un passaggio critico per garantire la qualità del DNA estratto. In alternativa al congelamento in azoto liquido, è possibile adottare tecniche più accessibili, come la conservazione a freddo (4-8°C) o l’impiego di carta FTA per la fissazione dei tessuti fogliari. Questo protocollo descrive strategie pratiche per mantenere l’integrità dei campioni in ingresso, anche senza l’uso di super-congelatori, permettendo una gestione più flessibile e sostenibile del materiale vegetale.

Esistono molteplici kit commerciali in grado di fornire DNA di alta qualità partendo sia da campioni di tessuti vegetali freschi che liofilizzati o congelati. Su castagno, abbiamo avuto modo di adattare sperimentare il protocollo DNeasy Plant Mini, che è una procedura standardizzata e affidabile per l’estrazione del DNA da tessuti vegetali Il presente protocollo riassume la procedura consigliata dal produttore così come sperimentata su foglie e gemme di castagno durante il progetto KasTrack. La guida dettagliata include istruzioni su come macinare correttamente i tessuti, evitare la degradazione del DNA e massimizzare la resa attraverso passaggi critici come la lisi, la purificazione con colonne spin e l’eluizione finale. Questo protocollo è particolarmente indicato per applicazioni di biologia molecolare in cui è fondamentale mantenere la purezza e l’integrità del DNA.

Il protocollo FTA PlantSaver rappresenta un metodo semplice e affidabile per la conservazione e la successiva purificazione del DNA da tessuto vegetale. La tecnica prevede la pressione diretta di foglie su una speciale matrice assorbente, in grado di trattenere il materiale genetico in modo stabile e sicuro per mesi. Dopo il trasferimento e l’asciugatura, piccoli dischetti della matrice vengono sottoposti a un processo di lavaggio e preparazione che li rende immediatamente utilizzabili per l’amplificazione PCR. Questo sistema è ideale per il campionamento rapido sul campo e la conservazione a lungo termine senza necessità di congelamento.

Il protocollo è un adattamento del metodo HotSHOT (Hot Sodium Hydroxide and Tris) e consente l’ottenimento di un preparato a base di DNA, direttamente utilizzabile per specifiche applicazioni di genotipizzazione. Basato sull’uso di una soluzione alcalina, il metodo non richiede kit commerciali né passaggi complessi di purificazione. In pochi minuti è possibile lavorare con gemme o foglie ed ottenerne un preparato adatto all’amplificazione PCR, purché la mix di reazione sia in grado di neutralizzare l’azione degli inibitori di PCR ancora presenti nel preparato. È particolarmente adatto per laboratori con strumentazione limitata o per screening rapidi su numerosi campioni.

Per leggere specifiche basi di DNA nei punti target identificati sul genoma del castagno utilizziamo una PCR allele-specifica basata su sonde FRET, sfruttando le tecnologie brevettate KASP® (Kompetitive Allele Specific PCR) e PACE® (PCR Allelic Competitive Extension), entrambe compatibili con i nostri primer e reagenti. Il protocollo prevede la preparazione di una miscela di reazione contenente master mix, assay mix e DNA, seguita da un ciclo termico specifico. Il tutto è progettato per garantire affidabilità e sensibilità. La compatibilità con preparazioni di DNA grezzo, che rende il metodo ancor più efficace per la genotipizzazione rapida e ad alta precisione del castagno, è garantito dall’uso degli specifici reagenti PACE® 2.0.